بررسی و مقایسه ریزغده زایی رقم های زودرس و دیررس گیاه سیب زمینی- قسمت ۱۱

۱-۷-۱- تولید غده[۱۰۳]:
با توجه به اینکه هدف اصلی کاربرد کشت بافت، بهبود تولید سیبزمینی در سطح مزرعه است، بنابراین کلیه روشهای به کار رفته باید توانایی خود را در شرایط مزرعه به اثبات برسانند. بطور مثال، در روشهای مختلف تکثیر نهایتا به گیاهچه میرسیم این گیاهچه بایستی بتواند در شرایط مزرعه رشد کرده و نهایتا تولید غده کند. ولی به دلیل اینکه گیاهچه در شرایط کنترل شده از نظر نوری و حرارتی رشد کرده، توانایی تحمل نوسانات شرایط محیطی را ندارد و در نتیجه اگر بلافاصله گیاه به شرایط مزرعه منتقل شود، سریعا از بین میرود، بنابراین نشاء کردن گیاهچه در شرایط مزرعه بدون این که تدریجا با شرایط محیطی سازگاری پیدا کند، بی نتیجه خواهد بود (وانگ و هو، ۱۹۸۵).
در طی چند سال اخیر توجه زیادی به تولید غده در شرایط درون شیشه شده است و تا کنون تحقیقات وسیعی در ابعاد مختلف، جهت رسیدن به شرایط ایدهآل انجام گرفته است.
مزایای تولید غده در شرایط درون شیشه عبارتند از:

برای دانلود متن کامل این پایان نامه به سایت  pipaf.ir  مراجعه نمایید.

  • امکان انتقال مستقیم ریزغده از آزمایشگاه به مزرعه (آکیتا و تاکایاما، ۱۹۹۴).
  • به دلیل اینکه غدهها دارای رکود هستند، ذخیرهسازی و ارسال آنها به سهولت انجام میشود (وانگ و هو، ۱۹۸۵).
  • تولید غده میتواند به مقدار زیاد و بدون در نظر گرفتن فصل خاصی انجام گیرد (باجاج و ساپوری، ۱۹۸۸).
  • در صورتی که غدهها از گیاهچههای عاری از بیماری بدست آیند، از نظر قوانین قرنطینه بینالمللی، ارسال آنها با مشکل مواجه نخواهد بود (دادس[۱۰۴]، ۱۹۸۸).
  • برای ارسال مواد گیاهی به سایر نقاط، اگر مرحله ترانزیت به تاخیر بیافتد، در صورتی که ماده ارسالی غده باشد، در کیفیت رشد بعدی آن افتی ایجاد نخواهد شد (دادس، ۱۹۸۸).
  • جهت حفظ ژرمپلاسم نیاز به کشت مجدد در محیط کشت جدید نیست (هوسی[۱۰۵] و استیسی[۱۰۶]، ۱۹۸۴).
  • سازگاری بیشتر با انواع ماشینهای کشت مکانیزه دارد (هوسی و استیسی، ۱۹۸۴).

بنابراین، با توجه به مزایای ذکر شده، از این روش میتوان جهت حفظ ژرمپلاسم و انتقال سریع نتایج آزمایشگاهی به مزرعه استفاده نمود.
فصل دوم
مروری بر تحقیقات انجام شده
با توجه به اینکه سیبزمینی دارای تکثیر رویشی میباشد، بنابراین گیاهان حاصل از تکثیر آن از نظر ژنتیکی با گیاه منشاء خود تفاوتی ندارند. به همین دلیل در کاربرد روشهای کشتبافت و تکثیر سیبزمینی بایستی از روشهایی که تنوع ژنتیکی ایجاد نمیکند استفاده کرد. یکی از روشهایی که دارای خصوصیت فوق باشد، روش کشت قلمههای ساقه و رشد جوانههای جانبی در محیط کشت مصنوعی (درون شیشه) است. اکثر محققین جهت تکثیر کلونهای سیبزمینی از این روش استفاده میکنند ولی شرایط و نوع استفاده ممکن است در بررسیهای مختلف متفاوت باشد. در ادامه مطلب به بررسی برخی از آنها و نتایج حاصله اشاره میشود.
لاوارنس[۱۰۷] و بارکر[۱۰۸] (۱۹۶۳) از جوانههای جانبی رویشی که در شرایط تاریکی رشد کرده بود، استفاده کرده و آنها را در محیط کشت وایت همراه با ۵/۲ میلیگرم در لیتر کلسیم پانتوتنات کشت دادند. هدف آنها از این آزمایش مطالعه درجه حرارتهای مطلوب، فتوپریود مناسب و غلظتهای مختلف ساکارز بود. نتیجهای که در این آزمایش حاصل شد به این صورت اعلام گردید که جهت غده زایی، استفاده از ساکارز در غلظت ۸% و روشنایی متوسط یا تاریکی مناسبتر است. همچنین فتوپریودهای ۸، ۱۶ و ۲۴ ساعت روشنایی برای غده زایی مطلوب نیست.
هارمی[۱۰۹] و همکاران در سال (۱۹۶۶) بیان کردند که افزودن تنظیم کنندههای رشد تنها در صورتی نمو ریزغدهها را افزایش میدهد که ساکارز کافی (۸%) تامین باشد.
در آزمایشی که روکا[۱۱۰] و همکاران (۱۹۷۸) روی تکثیر ارقام سیبزمینی انجام دادند، تکثیر مواد گیاهی در دو مرحله انجام شد. در مرحله اول از ساقه گیاهان عاری از عوامل بیماریزا، قلمههای تک جوانه برش زده و در محیط کشت پایه MS که با ۳% ساکارز و ۲ میلیگرم در لیتر کلسیم پانتوتنات و هورمونهای NAA و BAP و GA3 تکمیل شده بود، کشت دادند. سپس ظروف کشت شده در دمای ۲۴-۲۲ درجه سانتیگراد و شدت نور ۱۰۰۰ لوکس و فتوپریود ۱۶ ساعته قرار گرفتند.
در مرحله دوم، از گیاهچههای حاصل از مرحله قبل، قطعاتی را برش زده و درون فلاسکهای ۱۲۵ میلیلیتری محتوی ۱۵ میلیلیتر محیط غذایی کشت شدند. جهت رشد جوانههای جانبی کشتها را روی دستگاه شیکر با ۹۰ دور در دقیقه با فتوپریود و درجه حرارت مشابه مرحله قبل ولی شدت نور ۲۰۰۰ لوکس که توسط لامپهای فلورسنت ۴۰ وات ایجاد میشد، قرار دادند. آنها از این آزمایش چنین نتیجه گرفتند که استفاده از روش فوق بیشترین ثبات ژنتیکی را در گیاهان حاصل از تکثیر ایجاد میکند.
وانگ و هو در سال (۱۹۸۲) آزمایشی با هدف تولید انبوه غده سیبزمینی به روش درون شیشه انجام دادند. آنها جهت تکثیر از مواد گیاهی عاری از ویروس حاصل از کشت مریستم استفاده کردند و برای تولید غده، گیاهچههای عاری از ویروس را در یک محیط مایع محتوی محیط پایه MS همراه با BAP و ساکارز کشت نمودند. آنها در این تحقیق، روی مقادیر مناسب BAP و ساکارز مطالعه میکردند و به این نتیجه رسیدند که شرایط مطلوب جهت غده زایی انبوه در شرایط درون شیشه استفاده از محیط کشت مایع MS محتوی ۱۰ میلیگرم در لیتر BAP و ۸% ساکارز است. شرایط مطلوب جهت رشد را نیز دمای ۲۰ درجه سانتیگراد و فتوپریود ۸ ساعته با شدت نور ۱۰۰۰ لوکس تعیین کردند. در این تحقیق در مرحله غده زایی از فلاسکهای ۵۰۰ میلیلیتری محتوی ۲۰۰ میلیلیتر محیط کشت غدهزایی استفاده شد.
سنگر[۱۱۱] و دینگرا[۱۱۲] در سال (۱۹۸۴) جهت تکثیر مواد گیاهی حاصل از کشت مریستم با استفاده از روش کشت قلمه تک جوانه آزمایشی با هدف بدست آوردن گیاهچههای زیاد با ساقه و ریشههای قوی انجام دادند. در این آزمایش از غلظتهای مختلف NAA در محیط کشت استفاده شد. در پایان چنین نتیجه گیری شد که غلظت ۵/۰ میلیگرم در لیتر NAA بهترین غلظت جهت رشد ساقه و ریشه قوی گیاهچهها است.در این آزمایش گیاهچهها در شرایط نوری ۲۰۰۰ لوکس و فتوپریود ۱۶ ساعته و دمای ۲±۲۵-۲۰ درجه سانتیگراد قرار گرفته بودند.
هوسی و استیسی (۱۹۸۴) با آزمایشی که بر روی فاکتورهای موثر بر غدهزایی سیبزمینی در شرایط درون شیشه انجام دادند چنین نتیجه گرفتند که غدهزایی در محیط کشت دارای ۲ میلیگرم در لیتر BAP و ۶% ساکارز و در فتوپریود ۸ و ۲۴ ساعته انجام میگیرد. اما اثر تحریک کنندگی BAP در شرایط روز کوتاه بیشتر از روز بلند میباشد. هم چنین افزودن کلروکلین کلراید[۱۱۳] (CCC) به تنهایی باعث کاهش غدهزایی نسبت به حالتی که همراه با BAP در محیط کشت باشد میگردد. ABA دارای اثر کم و GA3 دارای اثر بازدارندگی بر روی غدهزایی است و نیز با بستن درب ظروف کشت، غده زایی محدود میشود ولی اگر از مواد جذب کننده اتیلن مثل زغال فعال[۱۱۴] استفاده شود تاثیری نخواهد داشت.
این محققین همچنین محیط مناسب برای ریزغدهزایی را محیط MS دارای ۲ میلیگرم در لیتر BAP و ساکارز ۶% و دورهی نوری ۸ ساعتی بیان کردند. هم چنین نشان دادند زمانی که BAP و CCC تامین باشد ساکارز ۶% برای غدهزایی بهینه است.
اسکیلد-رنتاسکلر و اسکمیدیش در سال (۱۹۸۴) از محیطهای MS دارای سایتوکینین ۱۴-۱۰ میلیگرم در لیتر و ساکارز ۶ تا ۸% برای ریز غدهزایی استفاده کردند و دریافتند در صورت عدم استفاده از سیتوکینین به عنوان محرک غدهزایی میبایست از دورههای نوری بلند با شدت زیاد و در صورت استفاده از سیتوکینین میبایست از دوره کوتاه نوری با شدت کم و یا تاریکی پیوسته استفاده کرد.
وانگ و هو در سال (۱۹۸۵) در آزمایشات خود جهت تولید گیاهچه حاصل از ساقه، ابتدا غدهها را با آب معمولی شسته سپس در محلول هیپوکلریت کلسیم[۱۱۵] ۱% به مدت ۱۰ دقیقه خیسانده و بعد با آب مقطر استریل شستشو دادند. پس از ضدعفونی، جهت شکستن رکود جوانهها غدهها را به مدت یک ساعت در محلول ۰۳/۰ میلیمول GAفرو برده سپس بر روی کاغذ صافی قرار دادند و در زمانهای مختلف با محلول یک میلیمول کلرید کلسیم آنها را مرطوب میکردند. جهت رشد ساقه، غدهها را در حرارت ۱۸ درجه سانتیگراد قرار داده و پس از رشد آنها را به قطعاتی که دارای یک جوانه جانبی باشد، تقسیم کردند. برای کشت قطعات سیبزمینی از محیط کشت MS محتوی ۱/۰ میلیگرم در لیتر GA3 و ۳% ساکارز استفاده شد. سپس جهت رشد در فتوپریود ۱۶ ساعته با شدت نور ۴-۳ کیلولوکس و دمای ۲۵-۲۲ درجهسانتیگراد قرار گرفتند.
تاور و همکاران در سال (۱۹۸۵) روش جدیدی جهت تولید غده در شرایط درون شیشه ارایه کردند. آنها در این روش از ۳ مرحله استفاده کردند:

  • مرحله اول: تکثیر اولیه با استفاده از قلمههای تک جوانه در محیط کشت جامد و شرایط نوری ۱۰۰۰ لوکس و فتوپریود ۱۶ ساعته که با استفاده از لامپهای فلورسنت ایجاد شد و دمای ۲۲ درجه سانتیگراد.
  • مرحله دوم: تکثیر ساقه در محیط کشت مایع بصورت تعلیقی که در این مرحله ساقههای حاصل از مرحله قبل پس از قطع ریشه و نوک ساقه به قطعاتی که دارای ۴-۳ جوانه جانبی باشند تقسیم میشود و به ظروف محتوی محیط کشت مایع منتقل میگردد. سپس ظروف بر روی دستگاه شیکر با ۶۰ دور در دقیقه با شدت ۱۰۰۰ لوکس و فتوپریود ۱۶ ساعته قرار میگیرند.
  • مرحله سوم: در این مرحله تولید غده انجام میگیرد و به دو صورت اجرا میشود. در نوع اول مخلوطی از CCC و BAP تهیه و به محیط تکثیر مرحله قبل (محیط کشت مایع) اضافه میگردد و در نوع دوم محیط کشت جدیدی که حاوی CCC و BAP با غلظت بالاست تهیه و جایگزین محیط کشت تکثیر مرحله قبل میشود. سپس کشتها به شرایط تاریکی دائم با درجه حرارت ۲۰ درجه سانتیگراد انتقال مییابد.پس از چهار هفته، غدهها برداشت میشوند.

روش فوق در مرکز تحقیقات بینالمللی سیبزمینی[۱۱۶] (CIP) بعنوان یک روش استاندارد مورد استفاده است و برای تولید غده در تعداد زیادی از ژنوتیپهای ارزیابی شده که موفق نیز بوده است.
لیزارگا[۱۱۷] و همکاران در سال (۱۹۸۶) در کتابچه راهنمای کشت بافت جهت عاریسازی از بیماری که از طرف مرکز تحقیقات بینالمللی سیبزمینی منتشر میشود جهت ضدعفونی سطحی مواد گیاهی، استفاده از الکل یا اتانول را پیشنهاد کردهاند. زیرا قدرت نفوذ آن را بین کرکها و مرطوب کردن سطح گیاه بسیار مناسب دانسته معتقدند اتانول میتواند به عنوان عامل ضدعفونی کننده اولیه به کار گرفته شود. پس از استفاده از الکل جهت ضدعفونی اصلی، موادی چون هیپو کلریت کلسیم یا سدیم مورد استفاده قرار میگیرد. البته هیپوکلریت کلسیم به دلیل اثرهای سمی، کمتر توصیه شده است. همچنین استفاده از مواد ضدعفونی کننده تجارتی مانند کلراکس (هیپوکلریت سدیم ۵%) به شرط کاهش غلظت آن تا ۵/.% را مفید دانستهاند. آنها همچنین اعلام نمودند هیپوکلریت در pH حدود ۶ بیشترین اثر را دارد و در pH برابر ۸ و بالاتر، اثر کمتری دارد.
استرید[۱۱۸] و همکارانش در سال (۱۹۸۶) روش تولید غده در شرایط درون شیشه در سه مرحله را همانند تاور ۱۹۸۵ مطرح میکنند. آنها همچنین اعلام میکنند این روش در بیش از ۵۰ ژنوتیپ موفق بوده است. آنها از آزمایشات خود نتیجه گرفتند که روکود غدههای تولیدی در شرایط درون شیشه میتواند تحت تاثیر طول روز در مرحله غدهزایی قرار گیرد. زمانیکه غدهها در شرایط روز کوتاه ایجاد شوند دارای دوره رکود ۶۰ روزه خواهند بود، البته در صورتی که در دمای ۴ درجه سانتیگراد نگهداری شوند، ولی اگر غدهزایی در شرایط تاریکی کامل انجام بگیرد، دوره رکود در شرایط مشابه برابر ۲۱۰ روز خواهد بود.
اپینوزا و همکارانش در سال (۱۹۸۶) در کتابچهی راهنمای ریزازدیادی و حفظ ژرمپلاسم، با استفاده از کشت بافت که از طرف مرکز بینالمللی تحقیقات سیبزمینی منتشر شده، روشهای استفاده از قلمههای تک جوانه در محیط کشت جامد و کشت قطعات ساقه چند جوانه در محیط کشت مایع به صورت تعلیقی را جهت تکثیر و ریزازدیادی توصیه میکنند. همچنین ترکیبات محیط کشت مورد استفاده جهت کشت قلمههای تک جوانه را محیط پایه MS به همراه ۲۵/۰ میلیگرم در لیتر اسید جیبرلیک، ۲ میلیگرم در لیتر کلسیم پانتوتنیک اسید، ۳% ساکارز و ۸/۰% آگار پیشنهاد کردند. پس از تهیه محیط کشت بایستی آن را به مدت ۱۵ دقیقه در فشار بخار ۵/۱ کیلوگرم بر سانتیمتر مربع و دمای ۱۲۱ درجه سانتیگراد اتوکلاو نمود.
تاور و همکارانش در سال (۱۹۸۷) تحقیقی بر روی اثر ترکیبات محیط کشت بر روی غدهزایی سیبزمینی انجام دادند و به این نتیجه رسیدند که جهت غدهزایی میتوان از محیط پایه MS با ۵۰۰ میلیگرم در لیتر CCC، ۵ میلیگرم در لیتر BAP و ۸% درصد ساکارز، استفاده نمود. آنها همچنین جهت افزایش تعداد و اندازه غدهها، آزمایشاتی انجام دادند و چنین نتیجه گرفتند که کاهش غلظت ازت اندازه غده را افزایش میدهد، همچنین استفاده از قلمه تک جوانه نسبت به استفاده از قطعات ساقه، تولید غده را بیشتر میکند.